文章目录

1 材料与方法

1.1 毒株、载体及细胞

1.2 实验动物

1.3 主要试剂及仪器

1.4 目的基因片段选取及重组表达质粒的构建

1.5 细胞转染及蛋白表达

1.6 表达产物的鉴定

    1.6.1 SDS-PAGE及Western blot

    1.6.2 蛋白N-糖基化分析

1.7表达产物的纯化及鉴定

1.8 免疫原性分析

    1.8.1 动物免疫

    1.8.2 MNT

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 重组表达质粒的鉴定

2.2 表达产物的鉴定

2.3 纯化产物的鉴定

2.4 免疫后小鼠血清抗体效价

3 讨论

文章摘要:目的真核表达H1N1型流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白胞外段,并分析其免疫原性。方法以H1N1型流感毒株基因组为参考序列,将H1N1 HA的胞外段氨基酸序列进行密码子优化后基因合成,将合成的目的基因片段与KS001载体连接,构建重组质粒KS001/HA,转染至Expi293F真核细胞,收集表达产物,进行12%SDSPAGE、Western blot及N-糖基化鉴定;将表达产物经Capto Q离子交换层析柱纯化,收集纯化产物进行12%SDSPAGE鉴定,BCA法测定蛋白浓度;用不同浓度的HA胞外段蛋白辅以佐剂免疫小鼠,通过病毒微量中和试验（microneutralization test,MNT）检测小鼠血清抗体效价。结果经菌液PCR、双酶切及测序鉴定证明质粒构建正确;表达的重组蛋白以单体形式存在,相对分子质量约70 000,N-糖基化丰富;重组蛋白与佐剂配伍后的各剂量组均产生针对H1N1型病毒特异性抗体,且阳转率≥90%。结论成功构建了重组质粒KS001/HA,并于真核细胞中表达,表达产物联合佐剂免疫小鼠后具有较好的免疫原性。

文章关键词:

论文DOI:10.13200/j.cnki.cjb.003483

论文分类号:R392-33